Entwicklung und Validierung von innovativen Diagnosemethoden zum Nachweis von Feuerbrand (E. amylovora)

Zuletzt geändert: 05.03.2018

Entwicklung und Validierung von innovativen Diagnosemethoden zum Nachweis von Feuerbrand (E. amylovora)

Eine langfristige Bekämpfungsstrategie von Feuerbrand erfordert eine Eradikation potentieller Infektionsquellen. Ein Ziel dieses EUPHRESCO-Projektes war die Entwicklung und Validierung von Methoden zur Stamm-Differenzierung von E. amylovora. Damit können mögliche Inokulum-Quellen identifiziert und nachverfolgt werden (Microbial Source Tracking - MTS). Auf Basis einer Genomsequenzierung wurden spezielle DNA-Sequenzen (VNTRs – Variable Number of Tandem Repeat) identifiziert und daran anknüpfend eine High-throughput-PCR-Methode entwickelt und validiert. Ein zweiter technischer Ansatz war die Typisierung der Plasmide von E. amylovora (pEa170 und PEa29) mittels duplex-PCR. Damit wurden 1534 verschiedene Stämme untersucht und ihre Prävalenz ermittelt. Das Plasmid pEa29 war am häufigsten zu finden, beim Plasmid pEa170 lag die Prävalenz zwischen 0 und 92,8%. Das gemeinsame Auftreten von pEa170 und pEa29 war selten (12%), Stämme ohne die beiden Plasmide kamen fast gar nicht vor (0,7%).

Ein weiteres Ziel dieses Projektes war die Validierung von neu entwickelten und publizierten Feuerbrand-Nachweismethoden im Labor und im Freiland. 8 verschiedene DNA-Extraktionsmethoden wurden mit 11 unterschiedlichen Pflanzenmatrices getestet. Es zeigte sich, dass die Pflanzenmatrix einen Einfluss auf die Zuverlässigkeit (Reliabilität) einer Methode hat. Durch einen Anreicherungsschritt während der Probenbearbeitung konnte das Detektionslimit erhöht werden. Je vier Protokolle von DNA-Extraktionsmethoden und neue Endpunkt und realtime PCR-Assays wurden in einer Test Performance Study validiert. Basierend auf diesen Ergebnissen eignen sich für den Nachweis von Feuerbrand aus asymptomatischen und symptomatischen Pflanzenmaterial folgende Methoden am besten: Bakterienisolierung mit Anreicherungsschritt, vier konventionelle PCR-Assays (Llop 2000, Taylor 2001, Stöger 2006 und Obradovic 2007) und ein real time PCR-Assay (Pirc 2009). Serologische Schnelltests (Ea Agristrips und Pocket Diagnostic) unterschieden sich nicht signifikant in ihrer Sensitivität, Spezifität und Genauigkeit und werden nur für den Feuerbrand-Nachweis in symptomatischen Pflanzenproben empfohlen.

Projektteilnehmer:
ERANET-EUPHRESCO AGES, IVIA-Spanien, ACW-Schweiz, NIB-Slowenien, INRA und LNPV-Frankreich

Projektdauer: 2008-2009

Webseite: www.dafne.at No. 100437

Förderstelle: BMLFUW

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